圓二色光譜不斷走向諸多領(lǐng)域
圓二色光譜利用蛋白質(zhì)的圓二色性及不對稱分子對左右圓偏振光吸收的不同來進行結(jié)構(gòu)分析。蛋白質(zhì)或多肽中主要的光活性基團是肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵等,當平面圓偏振光的吸收不相同時,會產(chǎn)生吸收差值。由于這種吸收差的存在,造成了偏振光矢量的振幅差,圓偏振光變成了橢圓偏振光,即蛋白質(zhì)的圓二色性。通過圓二色光譜,可以在一定程度上分析蛋白質(zhì)、多肽樣品的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)。
圓二色光譜的供試品,大多數(shù)情況下的蛋白質(zhì)和多肽。蛋白質(zhì)的精確濃度是計算樣品二級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵,一般要求樣品濃度為0.2μg/μl,濃度過高,測試時信號不好,需稀釋,樣品純度要在90%以上,不要添加任何保護劑或其它物質(zhì),樣品中應避免含有光吸收的雜質(zhì),緩沖劑和溶劑在配制溶液前最好做單獨的檢查,透明性極好的磷酸鹽可用作緩沖體系。圓二色光譜在遠紫外區(qū)的掃描圖譜,反映的是蛋白質(zhì)肽鍵的排布信息,計算所得的是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比例,即α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲的比例。
圓二色光譜在近紫外區(qū)的掃描圖譜,反映的是蛋白質(zhì)側(cè)鏈生色基團色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環(huán)境的變化。
圓二色光譜技術(shù)能快速、簡單、較準確地研究溶液中蛋白質(zhì)和多肽的構(gòu)象,并且運用斷流、電化學等附加裝置,結(jié)合溫度、時間等變化參數(shù),已經(jīng)廣泛用于了解蛋白質(zhì)-配體的相互作用,監(jiān)測蛋白質(zhì)分子在外界條件誘導下發(fā)生的構(gòu)象變化,探討蛋白質(zhì)折疊、失活過程中的熱力學與動力學等多方面的研究。
圓二色光譜在遠紫外區(qū)的掃描圖譜,反映的是蛋白質(zhì)肽鍵的排布信息,計算所得的是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比例;圓二色譜在近紫外區(qū)的掃描圖譜,反映的是蛋白質(zhì)側(cè)鏈生色基團色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環(huán)境的變化。圓二色光譜用于拆分和估算的軟件不下十幾種,得到研究者廣泛認同的計算模式有幾種,但由于不同計算模式的理論基礎(chǔ)不同,所計算得到的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比例并不完全相同,但多數(shù)軟件對α-螺旋的估計還是比較準確的。
圓二色光譜根據(jù)圓二色性的數(shù)據(jù)來推斷這些試劑對照相明膠的多級結(jié)構(gòu)的影響。實驗結(jié)果表明:這些試劑對明膠的圓二色性的影響是很強烈的,不同試劑不僅影響的程度不一樣,而且影響的方式也不盡相同。比如:對明膠的240nm附近的負槽圓二色性的影響,在KCNS、脲的濃度的增大過程中圓二色性先是減小,經(jīng)過一個最低值,然后濃度增大過程中,圓二色性一直是增大的。
圓二色光譜在硫脲濃度增大的過程中,圓二色性卻是迅速減小的,很快就減小到零。不管上述助劑各自對明膠的圓二色性影響怎樣,但它們都有一個共同點,就是:改變或部分改變了明膠的多級結(jié)構(gòu)。